Vanquish Duo多中心二维在线除盐串联高分辨质谱对司美格鲁肽药物杂质进行鉴定

1.实验方法

1.1仪器

Thermo Fisher Vanquish Duo多中心二维液相色谱仪串联高分辨质谱 Orbitrap Exploris 120泵:Binary Pump F (P/N:VF-P10-A)

Binary Pump F (P/N:VF-P10-A)自动进样器:Split Sampler FT(P/N:VF-A10-A)柱温箱:Column Compartment H(P/N:VH-C10-A)

Column Compartment H (P/N:VH-C10-A)WWD 检测:Variable Wavelength Detector F (P/N:VF-D40-A)质谱检测器:Orbitrap Exploris 120 (P/N BRE725531)

1.2试剂

磷酸二氢铵(HPLC级，CNW)、异丙醇(HPLC级，Merck)、乙腈(LC-MS级，Fisher)、甲酸(LC-MS级，CNW)、去离子水(18.2MO，Milipore纯水机)。

1.3样品信息

司美格鲁肽固体粉末，来自客户企业。称取适量样品用超纯水溶解至1.35mg/mL

3.实验结果

3.1一维方法重复性

本文采用Hypersll gold peptide 小粒径色谱柱和 Vanquish Flex超高效液相对司美格鲁肽原料药进行纯度分析，连续进样3次，色谱结果重复性好，见图3和表4。

3.2多中心 2D-LC-MS鉴定

面积归一法进行峰面积计算，对于图4中含量远低于0.1%的峰peak1，分别进行5次在线loop富集，考察在线富集效果。0eak1未在线富集进行二维除盐后的质谱图见图5的A和C，C为质荷比1032处放大;peak1进行在线富集5次后进行二维除盐后的质谱图见图5的B和D，D为质荷比1032处放大，可以看出在线富集效果显著，质谱图的响应达到2.4E，可以进行有效数据解析。peak1单同位素分子量4125.1021Da,在线富集5次后的二级碎片离子覆盖度见图6。图4中含量高于0.1%的peak2-peak11及主峰，进行直接在线除盐和质谱鉴定。图7和图8展示主峰前的peak2和peak3的质谱定性结果。通过上述方法结合Thermo BloPharmaFinder5.3软件鉴定该司美格鲁肽的杂质有氧化肽、酰胺化肽、缺失肽等。

4.结论

1、利用Hypersil gold peptide专用色谱柱和超高效液相色谱 Vanquish Flex能对该司美格鲁肽原料药的纯度进行较好的分离且重复性好。

2、多中心2D-LC-MS对含量非常低的peak1进行在线富集再除盐进质谱响应，比未富集的peak1的质谱响应明显提高。未富集的peak1的质谱数据质量没法进行解析。通过此在线富集方式，可以提高至少5倍的检测灵敏度，该方法对于低含量的物质的鉴定，具有很好的借鉴价值。

3、本方法对于含量不低于0.1%的杂质和主峰进行至少一次实验可以切割5个馏分，然后依次在线除盐进质谱鉴定，鉴定出该司美格鲁肽具有杂质:W25氧化肽、E21酰胺化肽、缺失肽等。多中心2D-LC方法相比较传统的单中心2D-LC方法效率提高5倍。

4、借助变色龙软件eWorkfow的优势，该方法可以便捷地转移到各种多肽类药物、小分子药物、生物药等2D-LC-MS的杂质鉴定。

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