化学药中有效成分含量分析检测方案

稳定和可靠的药代动力学(PK)数据是生物分析的重要组成部分。在定量生物分析中，LC-MS是首选的方法，因为该方法可获得较高的选择性和灵敏度。在本文中，我们介绍新型ionKey/MS系统用于血浆样品分析所体现出的良好稳定性，血浆样品采用简单的蛋白沉淀法(PPT)、液液萃取(LLE)、免疫亲和分离配合胰蛋白酶酶解(1A/TD)进行分别制备。

样品配制

蛋白沉淀法(PPT)

人血浆以2:1(乙腈:血浆)比例加入乙腈中，涡旋混合一分钟，随后在5,000相对离心力(RCF)下离心5分钟。之后取出上清液，用移液管转移到LC样品瓶中，进样到LC-MS系统中。每50次进样插入一针QC样品.按此规律重复进样，通过QC样品对色谱性能进行评价，QC样品由右美沙芬和普萘洛尔组成。

液液萃取(LLE)

人血浆以10:1比例加入己烷，涡旋混合一分钟，随后在5,000ORCF下离心5分钟。然后，把上清液转移至一个新的样品瓶中。吹干，并以初始体积的五分之一进行复溶，进样于LC-MS系统中。每20次进样插入一针QC样品，按此规律重复进样，通过QC样品对色谱性能进行评价，QC样品右美沙芬和普萘洛尔组成。

单克隆抗体的免疫亲和分离和胰蛋白酶消化(IA/TD)

人血浆用治疗性单克隆抗体(mAb)加标;使用免疫亲和磁珠捕获mAb。变性后用胰蛋白酶消化mAb。使用mAb消化产物进样1,000次，在每次LC-MS运行中监测两种特征肽，以评价在实验期间的色谱性能。

结果和讨论

生物分析实验室进行的常规分析，通常一个分析批包括2-4个96孔样品板，每块样品板中样品由实验人员采用下述方法进行制备，例如蛋白沉淀法;液液萃取法;或单抗等生物药使用免疫亲和分离及蛋白酶解。在这些方法中，蛋白沉淀法是最常用的，因为在进行小分子分析时，这种方法速度较快且成本较低。但是，这种前处理技术产生的样品洁净度也是最粗糙的。因此，选用这些最具挑战的生物样品前处理技术对新型150umiKey分离装置的稳定性进行实验。ionKey/MS系统由Xevo TQ-S质谱仪、ACQUITY UPLC M-Class、ionKey源和iKey分离装置组成，如图1所示。iKey分离装置以瓷制材料为主题，所有元件集中在一个单元，可直接插入质谱离子源中。

图2显示在通用的5分钟LC梯度过程中右美沙芬和普萘洛尔的分离情况。这里，我们观察到右美沙芬和普萘洛尔10%峰高处的峰宽为1秒。在这个峰高时，计算出的分离度是0.8。在图2中，我们看到在使用蛋白沉淀处理过的人血浆样品1L连续进样1000次(5天)后QC标准品的进样情况。值得一提的是，在150pm内径Key上1L进样相当于在传统2.1mm内径分析柱上200L进样。图2数据比较表明，在实验期间，峰对称性保持的非常好，色谱分离度也维持在0.9

图4显示在蛋白沉淀人血浆样品1000次进样过程中，从QC样品获得峰面积结果。这个数据进一步证明了系统稳定性，这不仅是指iKey分离装置、集成器件和质谱源的耐用性，而是证明了整个系统的稳定性。接下来将使用LLE方法制备的人血浆样本测试系统。这个实验采用与前一样品相同的实验条件。图5显示普萘洛尔和右美沙芬的QC标准品第1次进样和第1000次进样时的情况，证明在整个研究过程中保持了良好的色谱峰形和分离度，基本上与前一个实验结果相似。同时无明显的系统背压变化。

由于生物药如抗体药物的研发不断增加，使用常规亲和分离配合酶解，以及使用酶解后的肽段分析测试ionKey/MS系统的稳定性。如上述研究一样，将色谱性能和系统压力作为判断指标。在这个实例中，抗体经胰蛋白酶酶解后产生的特异性肽段用来进行分析。图6显示了实验过程中监测的两种特征肽在第1次进样和在第1000次进样时的峰形。在所采用的实验条件下，观察到的典型肽峰宽(在10%峰高时)是3-4秒。

结论

ionKey/MS系统采用了一种新型的150um内径Key分离装置，改单元使用1.7um色谱颗粒填料进行填充，使得该系统在生物分析中显示出以下优异性能:

优异的系统稳定性:对分别采用蛋白沉淀法、液液萃取法、免疫亲和分离配合胰蛋白酶酶解法制得的人血浆样品，1u连续进样1000针，结果显示系统稳定性良好。此进样量大约相当于在标准2.1mm内径色谱柱上的200L进样量。

在连续5天的试验期间，一对关键小分子能够维持极好的峰对称性和分离度。在第1次和第1000次进样时，在10%峰高时测定的分离度和峰宽分别是0.8和1秒。

在复杂单抗酶解样品的1000次进样中，就峰形和峰宽而言，色谱稳定性优异。

在整个研究过程系统压力恒定，表明无基质成分残留在窄内径管路及接头处。对于复杂生物分析，该系统不易堵塞发生超压及色谱性能下降等问题。

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