Vanquish Duo多中心二维在线除盐串联高分辨质谱的应用

化学合成多肽是介于小分子化学药物和蛋白质药物之间的一类药物，与小分子化学药物相比，其在制备工艺、结构确证和质量研究等方面均具有特殊性。多肽药物的工艺杂质一般包括氨基酸缺失、取代或插入肽、截断肽、异构体等；降解杂质一般包括乙酰化杂质、脱酰胺杂质、二硫键错配杂质、氧化杂质、消旋体、β- 消除杂质、低聚物等。欧洲药典将多肽药物相关杂质的报告限、鉴定限和界定限分别规定为 0.1%、0.5% 和 1.0%。FDA 规定多肽类化学仿制药（胰高血糖素、利拉鲁肽、奈西立肽、特立帕肽和替度鲁肽）的鉴定限和界定限分别为 0.1% 和 0.5%，其他多肽药物遵循具体问题具体分析的原则 [1]。2023 版《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》规定多肽相关杂质的报告限、鉴定限和质控限为 0.1%、0.5% 和 1.0%。若发现多肽药物杂质存在安全性隐患，应适当收紧杂质限度要求。

1.实验方法

1.1仪器

Thermo Fisher Vanquish Duo多中心二维液相色谱仪串联高分辨质谱Orbitrap Exploris 120

泵:Binary Pump F (P/N:VF-P10-A)

Binary Pump F (P/N:VF-P10-A)

自动进样器:Split Sampler FT(P/N:VF-A10-A)柱温箱:Column Compartment H(P/N:VH-C10-A)

Column Compartment H ( P/N:VH-C10-A)WWD 检测器:Variable Wavelength Detector F(P/N:VF-D40-A)质谱检测器:Orbitrap Exploris 120 (P/N BRE725531)

1.2试剂

磷酸二氢铵(HPLC级，CNW)、异丙醇(HPLC级，Merck)、乙腈(LC-MS级，Fisher)、甲酸(LC-MS级，CNW)、

去离子水(18.2MS，Millipore纯水机)。

1.3样品信息

司美格鲁肽固体粉末，来自客户企业。称取适量样品用超纯水溶解至1.35mg/mL

1.4色谱条件

2.实验结果

2.1一维方法重复性

本文采用Hypersll gold peptide小粒径色谱柱和 VanquishFlex超高效液相对司美格鲁肽原料药进行纯度分析，连续进样3次，

色谱结果重复性好，见图3和表4。

2.2多中心2D-LC-MS鉴定

面积归一法进行峰面积计算，对于图4中含量远低于0.1%的峰peak1，分别进行5次在线loop富集，考察在线富集效果。peak1未在线富集进行二维除盐后的质谱图见图5的A和C，C为质荷比1032处放大;peak1进行在线富集5次后进行二维除盐后的质谱图见图5的B和D，D为质荷比1032处放大，可以看出在线富集效果显著，质谱图的响应达到2.4E，可以进行有效数据解析。peak1单同位素分子量4125.1021Da,在线富集5次后的二级碎片离子覆盖度见图6。图4中含量高于0.1%的peak2-peak11及主峰，进行直接在线除盐和质谱鉴定。图7和图8展示主峰前的peak2和peak3的

质谱定性结果。通过上述方法结合Thermo BioPharmaFinder5.3软件鉴定该司美格鲁肽的杂质有氧化肽、酰胺化肽、缺失肽等。

3.结论

1、利用Hypersil gold peptide专用色谱柱和超高效液相色谱VanquishFlex能对该司美格鲁肽原料药的纯度进行较好的分离，

且重复性好。

2、多中心2D-LC-MS对含量非常低的peak1进行在线富集再除盐进质谱响应，比未富集的peak1的质谱响应明显提高。未富

集的peak1的质谱数据质量没法进行解析。通过此在线富集方式，可以提高至少5倍的检测灵敏度，该方法对于低含量的

物质的鉴定，具有很好的借鉴价值。

3、本方法对于含量不低于0.1%的杂质和主峰进行至少一次实验可以切割5个馏分，然后依次在线除盐进质谱鉴定，鉴定出

该司美格鲁肽具有杂质:W25氧化肽、E21酰胺化肽、缺失肽等。多中心2D-LC方法相比较传统的单中心2D-LC方法效

率提高5倍。

4、借助变色龙软件eWorkfow的优势，该方法可以便捷地转移到各种多肽类药物、小分子药物、生物药等2D-LC-MS的杂质鉴定。

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